30 лет назад Меклер, изучая механизм трансляции вирусных белков, предположил, что аминокислотные остатки, кодируемые кодоном и антикодоном, должны быть стереокомплементарны друг другу [1]. Это отношение между аминокислотными остатками впоследствии было названо А-A-кодом [2].

В 1981 г. Биро обнаружил, что последовательности ДНК, кодирующие пептидные гормоны и их рецепторы, имеют комплементарные участки. Биро высказал предположение, что белки, способные взаимодействовать друг с другом, могут кодироваться комплементарными последовательностями ДНК [6].

В 1982 г. Рут-Бернштейн, моделируя связывание аминокислот друг с другом, пришел к выводу, что только 26 аминокислотных пар отвечают стандартным критериям взаимодействия. Оказалось, что большинство из этих пар кодируется комплементарными триплетами [7].

В 1984 г. Блэлок и Смит обнаружили, что кодоны, кодирующие гидрофобные аминокислоты, комплементарны кодонам, кодирующим гидрофильные аминокислоты, и наоборот. Это явление они назвали “гидропатичной антикомплементарностью” [8].

Таким образом, четыре группы исследователей независимо друг от друга, используя разные подходы, пришли к сходным результатам. Однако только Меклер и Идлис сформировали на основании данной гипотезы развернутую концепцию.

Наиболее полно концепция Меклера и Идлис изложена в работе [2]. Утверждается, что существует “общий стереохимический генетический код”, состоящий из шести частных кодов. Два частных кода хорошо известны: это код, определяющий комплементарность нуклеотидов (Н-Н-код в терминологии Меклера) и генетический код трансляции (Т-код в терминологии Меклера). Другие частные коды были постулированы Меклером: А-A-код; А-Н-код, согласно которому аминокислотные остатки узнают свои антикодоны; П-К-код, согласно которому узнают друг друга два аминокислотных остатка одной и той же компоненты связности графа А-A-кода; согласно шестому коду аминокислотный остаток узнает все антикодоны той же компоненты связности.

Меклер и Идлис считают, что фолдинг белковых молекул происходит в клетке непосредственно по ходу их синтеза: “в результате последовательного образования – шаг за шагом – соответствующей совокупности А-A-связей”. Образующаяся таким образом конформация белка отличается от той, которая выявляется при помощи рентгеноструктурного анализа. Меклер и Идлис называют такую конформацию “жидкой” или “А-A-конформацией” и отождествляют ее с “расплавленной глобулой”.

Е.М. Попов посвятил критике концепции Меклера отдельную главу монографии [9]. На сегодняшний день это единственная работа, посвященная анализу этой концепции. Возражения Попова основаны на следующих аргументах.

1. Попов пишет, что “ввод кода А-A ... подрывает физические основы общепринятых трактовок межмолекулярных взаимодействий”. В частности, принято считать, что гидрофобные аминокислоты взаимодействуют преимущественно с гидрофобными, а гидрофильные – с гидрофильными.

2. Попов утверждает, что для сборки белковой цепи в нативную конформацию и ее стабилизации важны не взаимодействия отдельных аминокислотных пар, а кооперативный эффект одновременного взаимодействия целого ряда сближенных друг с другом остатков. Меклер же этому общепринятому принципу объемного узнавания противопоставляет свой принцип линейного узнавания.

3. По мнению Попова, предложенный Меклером и Идлис механизм А-A-связи не может обеспечить стабилизацию связи и стереокомплементарность аминокислотных остатков.

4. Попов считает, что реализация А-A-связей привела бы к унификации конформационных состояний аминокислот, в то время как в белках для многих аминокислот наблюдается несколько пространственных форм. Заметим, что данное возражение основано на предположении, будто все аминокислоты в белках участвуют в образовании А-A-связей, чего Меклер никогда не утверждал.

5. Попов отвергает утверждение Меклера о том, что белок в кристалле и в разбавленном растворе имеет различную конформацию. Он также считает неудачным отождествление “жидкой” конформации с “расплавленной глобулой”.

6. По мнению Попова, Меклер переоценивает место регулярных вторичных структур в пространственном строении кристаллов глобулярных белков, а также роль водородных связей в формировании вторичных структур. На этом основании отвергается идея П-К-кода.

Ряд возражений Попова связан со статистическим анализом аминокислотных контактов в белках и предсказаниями структуры полипептидов. К этим возражениям мы обратимся в следующих разделах.

К настоящему времени опубликовано более сотни экспериментальных статей, посвященных исследованиям антисмысловых (комплементарных) пептидов [22]. Наметилось три подхода к конструированию таких пептидов. В большей части работ антисмысловые пептиды синтезировались в соответствии с А-A-кодом. Есть также много работ, в которых использовались антисмысловые пептиды, синтезированные в соответствии с Р-Б-кодом.

В дальнейшем группа Фассины синтезировала таким образом еще ряд пептидов. Эти пептиды проявили высокое сродство к исходным пептидам [16, 17, 26–28].

Для изучения прямого связывания смысловых и антисмысловых пептидов использовались различные методы: иммуносорбентный (ELISA), твердофазный, аффинная хроматография, ЯМР и др. Правомерность использования каждого метода остается спорной. Определенные этими методами константы диссоциации комплексов комплементарных пептидов варьируют в широких пределах: от миллимолярных до наномолярных. Для большинства пептидов связывание с антисмысловым пептидом, обнаруженное в одних лабораториях, не было подтверждено в других. Тем не менее положительных результатов больше, чем отрицательных [22].

Значительная часть данных о взаимодействии смысловых и антисмысловых пептидов получена непрямыми методами (см. обзоры [14, 15, 18–22]).

В ряде работ было установлено, что гены, кодирующие пептидные гормоны и их рецепторы, имеют комплементарные участки [15]. Показано, что антитела, полученные к смысловым и антисмысловым пептидам, взаимодействуют между собой [15, 20]. Антитела к антисмысловым пептидам гормонов связывались с лиганд-связывающими центрами их рецепторов [14, 15, 18–20]. В ряде случаев антисмысловые пептиды выступали как антагонисты соответствующих пептидных гормонов, ингибируя вызываемый ими эффект [18, 33].

Следует отметить, что непрямые данные о взаимодействии смысловых и антисмысловых пептидов так же, как и данные о прямых взаимодействиях, не получили подтверждения в ряде работ [15, 18, 19, 22].

Таким образом, несмотря на противоречивый характер данных о взаимодействии смысловых и антисмысловых пептидов, эти данные в основном подтверждают гипотезу о комплементарности аминокислотных остатков.

Зулл и соавт. проверяли наличие в белках “антисмысловых последовательностей” к собственным фрагментам. Использовалась выборка из 132 белков. “Антисмысловые последовательности” из 4 аминокислотных остатков были обнаружены у всех исследованных белков, из 5–6 остатков – у большинства. Однако их количество оказалось меньшим, чем у случайных последовательностей, генерируемых компьютером [38].

Бараний и соавт. использовали несколько иной подход: они искали в белках последовательности, комплементарные согласно А-A-коду, причем количество комплементарных аминокислот в таких последовательностях должно было превышать 80%. Им удалось показать, что число таких участков в белках в 4 раза больше, чем для случайных последовательностей. Средний размер комплементарных участков составлял 15 аминокислотных остатков, среднее расстояние между ними – около 60 аминокислотных остатков. Более 60% комплементарных фрагментов были расположены в участках реверсивных поворотов (reverse turns). Авторы работы сделали вывод, что такие комплементарные участки играют важную роль в фолдинге белков [21].

В ряде работ [39–41] исследовалась частота контактов между аминокислотными остатками внутри белковых молекул. Габриэлян и Хайманн использовали матрицы аминокислотных контактов, полученные в этих работах, для проверки гипотез Меклера и Рут-Бернштейна. Средняя частота контактов, соответствующих Р-Б-коду, во всех трех случаях оказалась ниже среднего значения для остальных контактов. Для А-A-кода в двух случаях средняя частота контактов оказалась несколько выше, чем у остальных контактов, но эти различия не были значимыми согласно критерию Стьюдента. Авторы сделали вывод о том, что данные о внутрибелковых контактах не подтверждают гипотезы о стереокомплементарности аминокислотных остатков [42].

К аналогичному выводу пришел Попов на основе матрицы аминокислотных контактов, полученной С.Г. Галактионовым [9]. Однако в данной работе должной статистической обработки не проводилось.

Линде и соавт. исследовали контакты между аминокислотными остатками в областях контакта субъединиц. Частота контактов, соответствующих А-A-коду, оказалась чуть выше средней, но это превышение не было статистически значимым [43]. В другой работе было показано, что практически для всех 122 белков из проверенной выборки число контактов, соответствующих А-A и Р-Б-кодам, не превышает одной трети от межсубъединичных аминокислотных контактов [44]. Авторы этих работ сделали вывод, что структура межсубъединичных контактов не соответствует гипотезам Меклера и Рут-Берншейна [43, 44].

Черзе и Симон, проанализировав данные о 4612 белковых последовательностях, составили таблицы соседства аминокислотных остатков. В этих таблицах для каждой аминокислотной пары в зависимости от их взаимного расположения в полипептидной цепи рассчитаны значения “единиц отклонения” от случайного распределения. Оказалось, что аминокислоты, отстоящие друг от друга на расстоянии до 9 аминокислотных остатков, распределены неслучайным образом. Начиная с десятого положения, распределение становится равновероятным [45]. Чипенс проанализировал эти данные и пришел к выводу, что они свидетельствуют в пользу существования К-К-кода [46]. Однако вопрос, на наш взгляд, требует более детального рассмотрения.

Как видно из таблиц, пары, соответствующие А-A-коду, наиболее часто оказываются разделенными тремя–пятью аминокислотными остатками (положения 4–6). Это хорошо согласуется с представлением Меклера и Идлис о механизме сворачивания полипептидной цепи: именно в этих положениях преимущественно должны находиться аминокислотные остатки, образующие первичные А-A-связи [5].

Для ионных пар наиболее высокий уровень “отклонений” наблюдается в положениях 3 и 4. Однако общее количество ионных пар мало, и они не играют решающей роли в фолдинге. Что касается гидрофобных и полярных пар, то для них наиболее вероятным оказалось положение 3.

Итак, данные о соседстве аминокислот в полипептидных цепях могут служить косвенным свидетельством в пользу существования кодов А-A и П-К.

В 1992 г. комиссия в составе В.А. Геловани, Э.Г. Арутюняна, А.А. Замятнина и В.З. Плетнева проверяла способность Меклера и Идлис предсказывать структуру полипептидов. В слепом эксперименте проверялась способность на основании только первичной последовательности правильно определять положение S-S-связей для цистеинсодержащих пептидов.

В ходе проверки Меклеру и Идлис предъявлялись первичные структуры 17 пептидных молекул без указания каких-либо пространственных характеристик, в том числе и без указания положения их S-S-связей. Наименьший пептид (конотоксин MI) содержал 14 аминокислотных остатков и 2 S-S-связи. Шесть пептидов содержали по 3 S-S-связи, 3 пептида – по 4 S-S-связи. Наиболее сложной была молекула соевого ингибитора трипсина и химотрипсина (71 аминокислотный остаток, 7 S-S-связей).

Для всех 17 пептидов Меклер и Идлис правильно определили положения S-S-связей. Помимо этого, Меклер и Идлис построили совместно с Арутюняном и Замятниным модель металлотионеина человека (61 аминокислотный остаток, из них 20 остатков цистеина), которая совпала с результатами структурных исследований и удовлетворительно объяснила механизм связывания пептидом атомов металла [48].

Можно ли это утверждение воспринимать как критику? Попов не представил доказательств того, что его метод позволяет установить однозначность положения S-S-связей. Следует иметь в виду, что тахиплезин – один из наиболее простых пептидов, модель которых была построена Меклером и Идлис, и именно в качестве такового он был выбран для иллюстрации. Для того, чтобы оспаривать эффективность метода Меклера–Идлис в предсказании структуры пептидов, необходимо продемонстрировать с помощью иного метода возможность так же точно предсказывать вслепую положение S-S-связей.

В 1994 г. Меклер и Идлис приняли участие в первом конкурсе по предсказанию структуры белка CASP1, проходившем в Асиломаре (США). Они представили на конкурс модели двух белков. Одна из этих моделей (белка RTP) оказалась неудачной. Как признает сам Меклер, “при построении А-A-модели этого белка из бумажной ленты мы допустили ошибку в самом начале сборки модели, неверно оценив стерическую совместимость одной из А-A-связей с А-A-связями, уже до этого момента сформировавшимися” (из письма Л.Б. Меклера к А.А.Мигдалу, Интернет).

Для того, чтобы правильно оценить результаты проверки предсказаний Меклера и Идлис, необходимо иметь в виду, что предложенная ими концепция фолдинга белка состоит фактически из трех частей. Первая часть – это утверждение о том, что фолдинг происходит в результате образования А-A-связей. Вторая часть – это алгоритм формирования А-A-конформации, “центральная задача которого – отбор среди альтернативных вариантов А-A-связей энергетически наиболее выгодных” [2]. Наконец, третья часть – алгоритм перехода А-A-конформации в П-К-конформацию.

Результаты проверки способности Меклера и Идлис предсказывать положения S-S-связей свидетельствуют в пользу верности первой части концепции, поскольку вероятность случайного угадывания на основании ошибочных предположений в этом случае ничтожно мала. По-видимому, по крайней мере частично верна и вторая часть концепции. Вопрос о верности третьей части остается пока открытым.

Рассмотренный в настоящей статье материал дает основание считать, что гипотеза о стереокомплементарности аминокислотных остатков соответствует большому количеству экспериментальных фактов. В то же время есть факты, которые пока трудно объяснимы с позиций данной гипотезы. Нет окончательной ясности относительно того, какой вариант кода аминокислотного узнавания реализуется в действительности. Однако можно с уверенностью утверждать, что исследования в данном направлении являются перспективными и должны привести к результатам, имеющим важное значение для многих разделов биологии, биотехнологии и медицины.

Автор признателен Р.Г. Идлис за создание домашней страницы в Интернете, которая во многом помогла при написании данной статьи. Автор выражает благодарность А.М. Дейчману, Л.Н. Дроздову-Тихомирову, А.А. Замятнину, Д.М. Линде, В.В. Поройкову и Б.Н. Соболеву за ценные советы и критические замечания.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4. Zull J.E., Smith S.K. // Trends Biochem. Sci. 1990. V. 15. P. 257–261.

6. Biro J.C. // Med. Hypotheses. 1981. V. 7. P. 969–1007.

7. Root-Bernstein R.S. // J. Theor. Biol. 1982. V. 94. P. 885–894.

8. Blalock J.E., Smith E.M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 121. P. 203–207.

10. Blalock J.E., Bost K.L. // Biochem. J. 1986. V. 234. P. 679–683.

14. Blalock J.E. // Nature Med. 1995. V. 1. P. 876–978.

15. Blalock J.E. // Trends Biotechnol. 1990. V. 8. P. 140–144.

16. Fassina G., Cassani G., Corti A. // Arch. Biochem. Biophys. 1992. V. 296. P. 137–143.

17. Fassina G., Consonni R., Zetta L., Cassani G. // Int. J. Pept. Prot. Res. 1992. V. 39. P. 540–548.

18. Beattie J. // J. Endocrinol. 1990. V. 126. P. 179–181.

19. Tropsha A., Kizer J.S., Chaiken I.M. // J. Mol. Recogn. 1992. V. 5. P. 43–54.

20. Boquet D., Dery O., Frobert Y., Grassi J., Courand J.Y. // Mol. Immunol. 1995. V. 32. P. 303–308.

21. Baranyi L., Campbell W., Ohshima K., Fujimoto S., Boros M., Okada H. // Nature Med. 1995. V. 1. P. 894–901.

22. Root-Bernstein R.S., Holsworth D.D. // J. Theor. Biol. 1998. V. 190. P. 107–119.

23. Bost K.L., Smith E.M., Blalock J.E. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 1372–1375.

24. Fassina G., Roller P.P., Olson A.D., Thorgeirsson S.S., Omichinski J.G. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 11252–11257.

26. Fassina G., Cassani G. // Biochem. J. 1992. V. 282. P. 773–779.

27. Fassina G., Cassani G., Gnossi P., Fornasiero M.C., Isetta A.M. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 318. P. 37–45.

28. Fassina G. // Agents Action Suppl. 1995. V. 46. P. 109–120.

29. Knutson V.P. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 14176–14151.

30. Fassina G., Zamai M., Brigham-Burke M., Chaiken I.M. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 8811–8818.

31. Scapol L., Rappuoli P., Viscomi G.C. // J. Chromatogr. 1992. V. 600. P. 235–242.

32. Fassina G. // ImmunoMethods, 1994. V. 5. P. 121–129.

33. Davids J.W., El-Bakri A., Heal J., Christie G., Roberts G.W., Raynes J.G., Miller A.D. // Angew. Chem. 1997. V. 36. P. 962–967.

34. Derrick J.M., Taylor D.B., Loudon R.G., Gartner T.K. // Biochem. J. 1997. V. 325. P. 309–313.

35. Araga S., Galin F.S., Kishimoto M., Adachi A., Blalock J.E. // J. Immunol. 1996. V. 157. P. 386–392.

38. Zull J.E., Taylor R.C., Michaels G.S., Rushforth N.B. // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 3373–3380.

39. Roberts D., Bohacek R. // Int. J. Pept. Prot. Res. 1983. V. 21. P. 491–512.

40. Miyazawa S., Jernigan R. // Macromolecules. 1985. V. 18. P. 534–552.

42. Gabrielian A.E., Heymann S. // Biomed. Sci. 1990. V. 1. P. 311–313.

45. Cserzo M., Simon I. // Int. J. Pept. Prot. Res. 1989. V. 34. P. 184–195.

47. Anderson W.F., Ohlendorf D.H., Takeda Y., Matthews B.W. // Nature. 1981. V. 290. P. 754–758.

49. Defay T., Cohen F.E. // Proteins. Structure, Function, and Genetics. 1995. V. 23. P. 431–445.