Репрессор cro – один из кодируемых геномов фага белков – представляет собой полипептид, состоящий из 66 аминокислотных остатков [96]. Репрессор cro – один из двух репрессоров генома этого фага. Его функция состоит в связывании с тремя участками регуляторной области генов этих репрессоров – с1 и cro. Второй репрессор – белок с1 – представляет собой полипептид, состоящий из 236 аминокислотных остатков, определяющих нахождение фага в состоянии профага. При малой концентрации репрессора cro в клетке или in vitro – репрессор cro связывается с локусом O_R3 (рис. 9), блокируя в результате транскрипцию гена репрессора с1, что и ведет к развитию продуктивной инфекции – синтезу фага. При большой концентрации репрессор cro, кроме того, связывается с двумя другими локусами этой области – O_R2 и O_R1 – что ведет к репрессии транскрипции его собственного гена по принципу ауторегуляции или перекрестной стереокомплементарности. Детально механизм действия репрессоров cro и с1 изложен в статьях [98–100, 111–115].

Таблица 2 содержит трассу, реализуемую синтезирующейся полипептидной цепью этого белка при его превращении в трехмерную молекулу согласно коду А – А. Взаимное расположение аминокислотных остатков этой молекулы видно как на бумажной модели (рис. 10в и 10г), так и на модели, построенной из проволоки, как таковой (рис. 11), так и в составе комплекса репрессора cro с локусом О_R3 (рис. 12).

Для нахождения трассы свертывания полипептидной цепи удобно пользоваться картой комплементарности (таблица 3), представляющей собой треугольную матрицу размерности N x N, где N – число аминокислотных остатков данной полипептидной цепи. Единица, стоящая в i-той строке и в k-м столбце матрицы, означает, что i-тый и k-тый аминокислотные остатки комплементарны друг другу по А – А коду и, следовательно, в принципе, при формировании трехмерной молекулы полипептида могут образовать между собой А – А связь. Нуль – означает отсутствие между ними комплементарности и невозможность образования А – А связи. Матрица дает возможность легко находить все возможные варианты построения любого сегмента трехмерной молекулы и сравнивать их между собой, что позволяет отобрать оптимальный вариант свертывания полипептида. Оптимальным мы считаем такой вариант, который отвечает максимальному числу А – А связей и, следовательно, соответствует энергетически наиболее выгодному варианту организации данного сегмента молекулы полипептида на данный момент его существования. На матрице также показана трасса свертывания трехмерной молекулы, которую мы считаем оптимальной.

Трехмерная модель молекулы репрессора cro строится следующим образом. Взглянув на участок матрицы, отвечающий концу полипептидной цепи (верхний угол матрицы), видим, что первая возможная по А – А коду связь может возникнуть между тре-6 и арг-4. Однако, как упоминалось выше, между аминокислотными остатками, стоящими в первичной последовательности друг к другу столь близко, А – А связь стерически невозможна. Первая возможная А – А связь, как демонстрирует матрица, возможна между лей-7 и глу-2 или между лей-7 и глн-3. Эти варианты задают возможность образования спирали либо с шагом 5, либо с шагом 4. Теперь рассмотрим следующим сегмент, лей-7 – мет-12. Аминокислотные остатки этого сегмента могут образовать либо одну связь А – А с шагом 4, – связь асп-9 –иле-5, или одну связь с шагом 5, тир-10 – иле-5. Однако, во втором случае, кроме того, может образоваться одна ионная связь, асп-9 – арг-4, – и для двух рядов выполняется условие связности лиз-8, глу-3 и ала-11, тре-6. Поэтому предпочтение отдаем варианту спирали с шагом 5. В результате сформировался цилиндр, состоящий из двух витков спирали с шагом 5.

Рассмотрим теперь возможности следующего сегмента, мет-12 – тре-19. Аминокислотные остатки этого сегмента максимальное число А – А связей образуют в случае образования двух витков спирали с шагом 4: гли-15 – ала-11, тре-17 – арг-13, лиз-18 – ала-14, тре-19 – гли-15. В результате сформировалась структура, состоящая из двух витков спирали с шагом 4. Таким образом, на данной стадии модель представляет собой два соединенных друг с другом цилиндра, первый из которых сформирован из спирали с шагом 5, а второй – из спирали с шагом 4. Вторая спираль может быть по направлению либо идентичной, либо противоположной первой. Во втором случае возникают дополнительные А – А связи между арг-13 и тре-6, лиз-8 и фен-14, гли-15 и тре-6, вследствие чего предпочтение отдаем второму варианту. Определить, какая из этих спиралей правая, на данной стадии мы не можем. Выбор был сделан при построении комплекса репрессора cro с регуляторным участком его гена на основании критерия, о котором речь будет идти при построении этой модели. Согласно данному критерию, первая спираль левая, вторая – правая.

Рассмотрим возможности очередного сегмента – гли-24 – иле-30. Матрица демонстрирует, что данный сегмент формируется вокруг предыдущей структуры однозначно: возникают связи глу-27 – лей-23, сер-28 – гли-24, иле-30 – тир-26, в результате чего образуется виток спирали с шагом 4. На этой стадии молекула, в состав которой включилась уже почти половина общего числа ее аминокислотных остатков, приобретает форму буквы Р (рис. 10а и 10б). Легко видеть, что в ее структуре сформировались вертикальные ряды, состоящие из аминокислотных остатков одной компоненты связности, например, гли-15, тре-19, гли-24, сер-28 (третья компонента связности), а также фен-14, лиз-18, лей-23, глн-27 (вторая компонента связности).

Согласно данной модели (рис. 10в и 10г, рис. 11), молекула репрессора cro по форме напоминает разомкнутый браслет, высота которого 18 Å, а внутренний параметр 34 Å (от ала-66 до ала-29). Смыкающиеся чести браслета напоминают клешни краба, одна из которых укорочена. С противоположной стороны молекула cro имеет форму почти правильного шестиугольника, сторона которого 12 Å.

Регуляторный участок гена репрессора фага l показан на рис. 9. Хотя и утверждается [98–100, 111–115], что репрессоры c1 и cro связываются с нерасплетенным участком двойной сличали ДНК, мы, однако, полагаем, что этот участок частично расплетен и имеет трехмерную структуру, показанную на рис. 9, ибо согласно принципу линейного узнавания, полипептиды и полинуклеотиды могут узнавать друг друга только при наличии у обоих молекул однонитчатых сегментов.

Поскольку установлено, что репрессор cro наиболее эффективно связывается с областью О_R3, ясно, что на его поверхности должны находиться соответствующие пары аминокислотных остатков.

Установлено, что репрессор cro в растворе образует димер, и что этот димер блокирует in vitro транскрипцию генов c1 и cro, располагаясь в большой бороздке узнаваемого ими сегмента ДНК и экранируя от растворителя гуаниловые остатки -26, -27, и -28 верхнего грибка и гуаниловые остатки -33, -34, а -36 нижнего грибка области О_R3 и не экранируя адениловые остатки [98–100]. Видно, что высота браслета мономера равна высоте двуспиральной ножки узнаваемого им грибка. Можно полагать, что их взаимодействие начинается с узнавания находящимся на поверхности репрессора cro дипептидом арг-38–лиз-39 однонитчатого участка нижнего грибка локуса О_R3, представляющего собой антикодоны этих аминокислот. При этом однонитчатая петля полинуклеотидной цепи стелется по поверхности cro, подобно нити ДНК, охватывающей гистоновый остов нуклеосомы [101]. Вслед за этим молекула cro размещается в большой бороздке, плотно охватывая двуспиралъную ножку гриба. Об этом свидетельствует тот факт, что и внешний периметр грибка, и внутренний периметр молекулы cro примерно равны 32 Å. Можно полагать, что возникновение комплекса cro – ДНК фиксируется образованием А–А связи между гис-35 и мет-1, проходящими сквозь молекулу ДНК навстречу друг другу через 2 щели, имеющиеся в районе неспаренных нуклеотидов -35 и -28, соответственно. Примечательно, что для защелкивания браслета используется образование связи именно между этими аминокислотными остатками, поскольку метионин может узнать и связаться только с гистидином. Возможно, что, кроме того, комплекс стабилизируется также за счет образования А–А связей иле-30–асп-47, ала-29–гли-48.

Нельзя не обратить внимание на тот факт, что дипептид арг-38 – лиз-39 у остальных пяти однонитчатых петель грибков может узнавать только один антикодон, а именно соответствующий арг-38. Это означает, что прочность связи молекулы cro с этими грибками должна быть намного меньше, чем с нижним грибком локуса О_R3, но именно это и наблюдается в действительности [98–100, 111–115]. Более того, совсем недавно показано [111–114], что мутации в локусе О_R3, приводящие к тому, что вместо антикодона нижней петли, соответствующего арг, в ней образуется антикодон, соответствующий сер, ведут к тому, что прочность связывания репрессора cro с этим участком резко уменьшается, что соответствует утрате этой петлей способности узнаваться и связываться с двумя аминокислотными остаткам – арг-38 – лиз-39. А это означает, что у данного мутанта прочность связывания репрессора cro со всеми шестью петлями грибков должна быть примерно одинаковой.

Из сказанного выше ясно, что для связывания с грибком достаточно узнавания молекулой cro одного антикодона. Применительно к молекуле cro, связывающейся с верхним грибком локуса О_R3, это означает, что в результате от растворителя будут экранироваться гуаниловые остатки -26, -27, -28, -33, -34 и -36, и оставаться свободными, доступными для метилирующего агента, гуаниловые остатки -31 и -32 и все адениловые остатки локуса О_R3 (рис. 9 и рис. 12), что и наблюдается в действительности. Резюмируя сказанное выше, мы видим, что узнавание и связывание димером репрессора регуляторного участка cro приводит к его фиксированию в конформации, при которой транскрипция гена, кодирующего репрессор, становится невозможной.

Выше упоминалось, что при большой его концентрации в среде репрессор cro, связываясь с локусом О_R1 , блокирует транскрипцию своего собственного гена, в чей находит выражение принцип перекрестной стереокомплементарности. Можно полагать, что резкое различие между константами связывания cro с локусами О_R3 и О_R1 соответственно, вызвано тем фактом, что одна из однонитчатых петель локуса О_R3 может связываться с двумя аминокислотными остатками, тогда как обе однонитчатые петли грибка О_R1 – только с одним – арг-38. Что касается механизма защелкивания браслета вокруг ножек грибков локуса О_R1, мы полагаем, что он тот же, что и в случае О_R3. Анализ последствий взаимодействия репрессора cro с ДНК, механизма его взаимодействия с репрессором с1 и механизма дерепресии выходит за рамки данной статьи.

Выше упоминалось, что белок cro в растворе существует в виде димера. В связи с этим, возникает вопрос, образование А–А связей между какими аминокислотными остатками двух молекул cro приводит к образованию его димера? Согласно принципу линейного узнавания, ответственными за такой процесс могут быть лишь аминокислотные остатки однонитчатых сегментов молекулы, комплементарные друг другу по коду А–А. Построенная модель демонстрирует, что в трехмерной молекуле репрессора cro есть три таких петли. Состав первой –(сер-28) – ала-29 – иле-30 – асн-31 – лиз-32 – ала-33 – иле-34. Состав второй – гли-37 – арг-38 – лиз-39 – иле-40 – (фен-41). Состав третьей –тре-6–лей-7–лиз-8–асп-9–тир-10–ала-11–мет-12. Примечательно, что два первых сегмента полностью, а третий частично, удовлетворяет критериям, определяющим способность сегмента полипептидной цепи служить антигенным детерминантом [37, 38] , а для первых ответственны одновременно и за ключевые функции белка cro: второй – за образование комплекса с регуляторными локусами ДНК, а первый – за стабилизацию этого комплекса. Важно, что аналогичная бифункциональность характерна, по крайней мере, и для однонитчатых сегментов полипептидной цепи молекул лизоцима и миоглобина [37, 38]. Рис. 10г демонстрирует, что эти однонитчатые сегменты, по-видимому, могут быть ответственными и за образованием димера: к образованию может привести образование А–А связей между аминокислотными остатками второго антигенного детерминанта: сер-28–ала-33, сер-28–ала-33, иле-30–асн-31, иле-30–асн-31. Это обстоятельство наводит на мысль, что за кристаллизацию того или иного белка также могут быть ответственны комплементарные друг другу антигенные детерминанты его молекулы. В связи с этим, следует заметить, что, по крайней мере для миоглобина, такого рода комплементарность, действительно, имеет место [33].

Итак, мы видим, что репрессор cro представляет собой молекулярную мини-машину, состоящую из трех элементов-узлов: опорной части и двух подвижных частей, крепящихся на опорной – большой и малой клешни-манипулятора. В основе опорной части лежат два вертикальных ряда аминокислотных остатков, удовлетворяющих критерию связности: ала-11, гли-15, тре-45, ала-52, сер-60 (третья компонента связности), тир-10, иле-5, асп-45, вал-50 (первая компонента связности). Судя по имеющемуся опыту, по аналогичному принципу построены и молекулы других белков, в частности, лизоцима, речь о чем пойдет ниже.

Продолжение

Оглавление

Титульный лист | Физико-химическая биология | Меклер