Трасса, реализуемая синтезирующейся полипептидной цепью лизоцима при ее превращении в трехмерную молекулу, детерминируемую А – А кодом, приведена в таблице 4. Взаимное расположение аминокислотных остатков показано на модели, изготовленной из бумаги (рис. 13). Для сравнения см. фотографии молекулы лизоцима, построенные по результатам рентгеноструктурного анализа, на которых показано строение и локализация антигенных детерминантов, установленные Атасси и Ли [42]. Техника построения модели и критерии решения и отбора вариантов – те же, что и при построении модели трехмерной молекулы белка cro. Поэтому ниже приводим лишь общее описание построения модели.

Модель трехмерной молекулы лизоцима строится следующим образом. Сначала формируется первый домен. Он состоит ив четырех витков спирали с шагом 4. Затем строится второй домен, состоящий из 2,5 витков спирали с шагом 10. Решающей для образования данного домена является связь сер-24 – гли-16. Следующим шагом является построение третьего домена. Этот домен состоит из двух витков спирали, шаг которой 12. Решающими для его формирования являются связи арг-45 – тре-40, сер-50 – тре-47, направленные перпендикулярно оси спирали, а не параллельно ей, как обычно. Впоследствии в состав этого домена включаются еще 2 витка спирали, образующиеся из аминокислотных остатков СООН-половины цепи при ее возвращении к NH₂-концу молекулы и движении между ранее сформировавшимися цепями 4-го и 3-го доменов по принципу молнии.

Построение 4-го домена начинается с сегмента арг-61 – цис-64. Легко видеть, что данный сегмент представляет собой шпильку, благодаря образованию которой полипептидная цепь изменяет направление своего движения на обратное и начинает двигаться к NH₂-концу молекулы. Примечательно, что этот поворот, как и при построении молекулы репрессора cro, совершается именно на середине полипептидной цепи молекулы.

Четвертый домен образуется в результате построения 2,5 витка спирали с шагом 16÷18. Есть все основания полагать, что данный домен представляет собой рабочий элемент фермента-машины [73, 110], движение спиралей которого друг относительно друга и неподвижного остова молекулы и приводит к реакции, катализируемой ферментом-лизоцимом. Однако подробнее об этом будет рассказано в других статьях. Завершается построение данного домена формированием структуры, которая, как показали Атасси и сотр. [42, 45], является одним из антигенных детерминантов молекулы лизоцима (красным антигенным детерминантом на фото статьи [42]). Обратим внимание на тот факт, что у конца этого антигенного детерминанта стоит один из S–S мостиков молекулы.

Следующая стадия – завершение формирования второго и третьего доменов. Ее конечный результат – также окончание формирования одного из антигенных детерминантов лизоцима – в данном случае желтого [42]. И снова, на конце антигенного детерминанта формируется S–S мостик.

Затем следует завершающая стадия – окончание формирования 1-го домена. Как и ранее, процесс завершается формированием антигенного детерминанта – на этот раз синего [42] . И снова, как и в первых двух случаях, у конца антигенного детерминанта устанавливается S–S мостик. Поскольку, как мы это теперь уже знаем [37, 38, 49], антигенные детерминанты представляют собой линейные олигопептиды, боковые остатки большей части аминокислот которых не образуют связей, детерминируемых А – А ходом, с другими аминокислотными остатками данной молекулы, ясно, что в местах их локализации жесткость конструкции молекулы резко уменьшается, и мы видим, как это ослабление конструкции здания тут же компенсируется установлением дополнительного перекрытия – S–S мостика! Существенно, что S–S мостики стоят там, где изменяется шаг спирали, что также ведет к ослаблению конструкции молекулы.

Удивительно и строение самой трехмерной молекулы в целом. Верхняя ее часть напоминает голову, центр – корпус тела. Третья – подвижная ее часть – конечности. Легко видеть, что в основе подвижности третьей части лежит наличие на концах спирали 4-го домена петель и двух S–S мостиков. Благодаря такой конструкции эти петли могут скользить друг относительно друга на 4 шага–аминокислотных остатка. Не менее удивительно, что такого рода скольжение приводит к перераспределению остатков – разрыву прежних S–S мостиков: цис-64 – цис-80 и цис-76 – цис-94 и образованию двух новых: цис-64 – цис-76 и цис-94 – цис-80. Одновременно возникает и новая система А – А связей, из которых особо обращают на себя внимание связи, образуемые между двумя рядом стоящими остатками лизина лиз-96 – лиз-97, с одной стороны, и двумя рядом стоящими остатками лейцина, лей-84 – лей-85, с другой, как бы замыкающими новое положение подвижного элемента молекулы – ее рабочих рук. Однако, вопрос о роли, играемой таким движением в каталитическом акте, анализируется в другой статье.

Не менее интересно, что рабочие элементы молекулы лицозима – ее руки и антигенные детерминанты – ее органы чувств – расположены только с одной ее стороны, которую мы условно назовем лицевой. Своеобразно устроена и противоположная сторона молекулы – ее остов – как у молекулы репрессора cro – опорная часть, на которой держится вся конструкция. Легко видеть, что основу этой части молекулы составляют 4 вертикальных ряда: 1) тир-20, цис-30, цис-115, тре-40, сер-86 и арг-68; 2) асп-119, асп-19, вал-29, асн-39, мет-106, асп-8 и тре-89; 3) вал-120, асн-18, три-28, фен-38, асн-106, иле-80, про-70; 4) глн-121, лей-17, асн-27, асп-37, ала-107, тре-89 и гли-71. Бросается в глаза, что из 6 аминокислотных остатков первого вертикального ряда 5 относятся только к 3-ей компоненте связности, из 7 аминокислотных остатков второго вертикального ряда – 6 относятся только к 1-ой компоненте связности, из 7 аминокислотных остатков 3-го ряда – четыре относятся к первой компоненте связности, а из 7 аминокислотных остатков 4-го ряда – два к первой, два ко второй и три к третьей компоненте связности. Поскольку эти вертикальные ряды стоят рядом друг с другом, ясно, что такого рода избирательность не является случайностью, а напротив, свидетельствует о том, что аминокислоты, относящиеся к той или иной компоненте связности, используются для выполнения задач, свойственных каждой компоненте.

Своеобразную роль выполняет остаток триптофана. Он ставится на участках, где полипептидная цепь резко изгибается. Так, три-62 и три-63 стоят в участке полипептидной цепи лизоцима, который резко изгибается при сдвиге цепей домена 4 друг относительно друга, три-108 – на участке, изгибающемся при переходе возвращающейся к NH₂-концу полипептидной цепи с шага спирали 18 на 12, а три-123 – на участке, изгибающемся при переходе от домена 2 к домену 1.

Конечно, лучше всего было бы сравнить данную модель с моделью, построенной Д.Филлипсом с сотрудниками [76, 82] по результатам рентгеноструктурного анализа, сопоставив координаты соответствующих аминокислотных остатков, ибо, судя по [44], конформация молекул лизоцима в растворе и в кристалле хотя и не идентична, но близка. Однако, в силу чисто технических причин, мы такой возможностью не располагаем. Тем не менее, сопоставление детального описания модели, построенной по результатам рентгеноструктурного анализа [76, 82], с моделью, построенной нами по А – А коду, демонстрирует, что обе эти модели удовлетворительно согласуются друг с другой. Справедливость этого утверждения видна из следующего.

1. Резкие изменения направления движения синтезирующейся полипетидной цепи – ее повороты порядка 90–180°, – определяющие величину ее сегментов и их макроукладку, как свидетельствует таблица 5, – и согласно модели, построенной Д.Филлипсом, и согласно данной модели происходят у одних и тех же аминокислотных остатков. В ряде случаев, однако, (5 из 18) отмечаются различия в тонком строении соответствующих сегментов, а также различия в относительном положении друг относительно друга ряда сегментов.

2. Участок полипептидной цепи, состоящий из аминокислотных остатков 3–17, согласно данной модели, так и согласно модели, построенной Д.Филлипсом [82], представляет собой спираль, несколько отличающуюся от классической a -спирали. В данном случав это отличие формально состоит в том, что шаг этой спирали не 3,6, а 4. Участок 88–96, – этот участок по Д.Филлипсу также является искаженной a-спиралью, может превратиться в спираль с шагом 4 при уплотнении молекулы, что, вероятно, имеет место в действительности при кристаллизации лизоцима. Такая спираль образуется в результате возникновения А – А связей между сер-86 – ала-90, цис-94 – ала-90 и сер-91 – ала-95. В модели, построенной Д.Филлипсом, спирализован, однако, и участок 24–34. Следует подчеркнуть, что на основе А – А кода этот участок в спираль с шагом 4 превратиться не может. Возможно, что он превращается в a-спираль при кристаллизации. В пользу этого соображения свидетельствует ранее высказанная идея, согласно которой в основе кристаллизации белков лежит взаимодействие антигенных детерминантов соседних молекул, ибо в состав этого участка как раз и входит один из антигенных детерминантов – в данном случае желтый. При взаимодействии с другим антигенным детерминантом и прилежащими аминокислотными остатками возможность разрушения кодовых связей А – А весьма велика, а согласно Розе и Роу [14] именно распад гидрофобных областей и ведет к обратимому возникновению a-спиралей в молекуле лизоцима*. Существенно, что, как пишет Д.Филлипс, этот участок превращается в спираль, наиболее сильно по сравнению с другими спирализованными участками молекулы лизоцима отклоняющуюся от классической a-спирали.

3. Участок полипептидной цепи, состоящий из аминокислотах остатков 41–54, так же, как и в модели, построенной Д.Филлипсом, укладывается сам на себя и образует структуру, геометрически (но не по причинам ее возникновения) идентичную складчатому листу, у которого аминокислотные остатки 46–49 образуют шпильку.

4. Первые 40 аминокислотных остатков, – спирали с шагом 4 и 10 – как и в модели, построенной Д.Филлипсом, – образуют компактную структуру, находящуюся на одном из концов, далее условно называемом верхним, длинной оси эллипсоидальной молекулы лизоцима. На противоположном конце этой оси, как и в упомянутой модели, находятся аминокислотные остатки 65–75, а на противоположных концах малой оси молекулы – аминокислотные остатки 100–103 и 35–37 (см. рис. 7 статьи [82]).

5. Первая часть домена 4 – участок полипептидной цепи 47–86, – как и в модели лизоцима, построенной Д.Филлипсом, образует структуру типа двух крыльев.

6. Как и в упомянутой модели, в данной модели молекулы лизоцима также имеется глубокая щель и также эта щель расположена с одной, лицевой стороны молекулы. Расположение в этой щели субстрата лизоцима – гексасахарида, состоящего из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, – при котором положение его колец соответствует показанному на модели, построенной Д.Филлипсом (рис. 7 статьи [82]), демонстрирует, что в области, занимаемой тем же субстратом в данной модели (рис. 13), действительно, располагаются все 24 аминокислотных остатка, согласно упомянутой модели входящие в состав активного центра лизоцима (на данной модели эти аминокислотные остатки помечены буквами АЦ).

7. Аминокислотные остатки активного центра, согласно модели, построенной Д.Филлипсом, находящиеся рядом друг с другом (асп-52, глн-57, арг-45, сер-50 и фен-59), (сер-72, сер-90, асн-59 и арг-61) [82], контактируют друг с другом также и согласно данной модели.

8. Аминокислотные остатки, согласно [82] контактирующие с кольцом F, находятся рядом с этим кольцом и в данной модели. Совпадает также положение глн-57, асн-59 и три-63 относительно кольца С и асн-52, асн-46 и ала-107 относительно кольца D. Однако, согласно данной модели три-108 расположен не у кольца С, а между кольцами D и E, а вал-109 и глу-35 – не у кольца D, а у кольца E.

9. Аминокислотные остатки, входящие в состав антигенных детерминантов “синий” и “красный”, соответственно, расположены друг относительно друга так же, как и в модели, построенной Атасси и Ли [42] применительно к модели, построенной Д.Филлипсом [82]. Однако, согласно [42] аминокислотные остатки “желтого” антигенного детерминанта расположены в порядке лиз-116 – асн-113 – арг-114 – фен-34 – лиз-33, тогда как согласно данной модели они расположены в порядке лиз-116–арг-114–асн-113–фен-34–лиз-33. Причины этого расхождения – образование в модели Д.Филлипса в этой области a-спирали и отсутствие таковой в данной модели.

10. Положение антигенных детерминантов относительно других частей молекулы полностью согласуется с приведенным Атасси и Ли [42]. Так, антигенный детерминант "синий" направлен по правой спирали, "красный" – по левой спирали, первые два аминокислотных остатка "желтого" – по правой спирали, а остальные три – по левой спирали.

11. Дисульфидные связи, согласно данной модели, образуются в тех же положениях, которые установлены анализом первичной структуры лизоцима [101]. Дисульфидные мостики цис-64 – цис-80, цис-30 – цис-115 и цис-6 – цис-127 экранированы от растворителя другими участками полипептидной цепи молекулы, что соответствует тому факту, что дисульфидные связи лизоцима не восстанавливаются тиолами, если третичная структура молекулы не разрушена [102]. Однако четвертый дисульфидный мостик не экранирован.

12. Оценивая степень сходства моделей молекулы лизоцима, построенной Д.Филлипсом и данной, на субмолекулярном уровне, мы видим, что согласно обоим этим моделям эта молекула построена из 4-х доменов. Состав соответствующих доменов, следуемый как из первой, так и из второй модели, близок друг к другу. Так, согласно первой модели, домен I строится из аминокислотных остатков 3–16, а согласно второй – из аминокислотных остатков 3–17, домен II – из аминокислотных остатков 20–39 и 18–40, соответственно, домен III – из аминокислотных остатков 43–54 и 41–60, соответственно, а домен IV – из аминокислотных остатков 57–86 и 61–100, соответственно. Оставшаяся часть полипептидной цепи, возвращаясь к NH₂-концу, дополняет домены I и II. Трассы этого пути совпадают.

Нельзя, однако, не заметить, что несмотря на столько хорошее совпадение между положениями, занимаемыми упомянутыми аминокислотными остатками, согласно первой и второй модели, по общей форме молекулы эти две модели существенно отличаются друг от друга. Так, согласно модели, построенной Д.Филлипсом, молекула данного лизоцима по форме близка эллипсоиду вращения, тогда как согласно данной модели она имеет форму усеченного и полного конусов, основания которых совмещены друг с другом.

В чем же причина этого различия? Ответ на этот вопрос можно попытаться получить, анализируя результаты рентгеноструктурного анализа комплекса, образуемого лизоцимом с трисахаридом, состоящим из одного остатка N-ацетилглюкозамина и двух остатков N-ацетилмурамовой кислоты [103]. Установлено, что в кристаллах этого состава гуанидиновая группа арг-125 контактирует с кольцом В этого субстрата, соединенного с соседней молекулой лизоцима. Имея в виду тот факт, что арг-125 находится на конце большой оси молекулы лизоцима, а кольцо В субстрата, связавшегося с молекулой лизоцима, на ее меньшей оси, можно полагать, что при кристаллизации лизоцима домен I его молекулы изгибается таким образом, что оказывается в контакте со спиной остальной части молекулы, а быть может, и внутри кольца, образуемого доменом II. В результате арг-125, продолжая оставаться на большой оси молекулы, приближается к ее центру, что и приводит к тому, что молекула лизоцима приобретает форму эллипсоида вращения, а гуанидиновая группа арг-125 получает возможность контактировать с кольцом В молекулы субстрата соседней молекулы лизоцима, – ее "красным" АД.

Такого рода модификация формы молекулы лизоцима, происходящая при его кристаллизации, позволяет также понять, почему в положении модели, показанном на рис. 1 [42], мы полностью видим "красный" и "синий" антигенные детерминанты, но вовсе не видим "желтый", а в положении, показанном на рис. 2 [42], полностью видим лишь "желтый" , а из состава двух других – три аминокислотные остатка синего и лишь один – красного антигенного детерминанта (АД).

Резюмируя все сказанное выше, мы полагаем, что есть все основания утверждать” что модель трехмерной молекулы лизоцима, построенная согласно А – А коду, соответствует реальной, синтезируемой в клетке, но находящейся в составе кристалла лизоцима, конечно, соответствует не полностью.

Продолжение

* Об этом свидетельствуют и результаты экспериментов [120], с которыми мы ознакомились уже после написания данной статьи, посвященных изучению степени связывания молекулами лизоцима молекул воды и диоксана в растворах вода – диоксан, при концентрации диоксана, постепенно возрастающей до 58%. Оказалось, что при возрастании концентрации диоксана до 10%, связывание его лизоцимом сначала возрастает, затем в области концентрации диоксана от 10 до 40% постепенно уменьшается и, наконец, в области от 40 до 58% снова резко возрастает. Примечательно, что по мере возрастания концентрации диоксана примерно параллельно возрастает и степень a -спирализации молекулы лизоцима. С позади данной концепции этот феномен вполне понятен. Так, на первой стадии молекулы диоксана связываются с остатками неполярных аминокислот, находящихся на поверхности молекул лизоцима. Затем, по мере возрастания концентрации диоксана, А – А связи, образуемые аминокислотными остатками остова молекулы лизоцима, распадаются. Это ведет к трем эффектам: 1) к освобождению большого числа как полярных, так и неполярных аминокислотных остатков остова молекул лизоцима; 2) к связыванию полярными аминокислотными остатками дополнительного числа молекул воды (что и наблюдается в этой области концентраций диоксана); 3) к вытеснению освободившимися из А – А связей остова неполярными аминокислотными остатками тех молекул диоксана, которые ранее связались с неполярными аминокислотными остатками поверхности лизоцима, что и ведет к суммарному уменьшению связывания диоксана лизоцимом в данной области концентраций диоксана, и, наконец, 4) при дальнейшем увеличении концентрации диоксана – к распаду всех А – А связей. Вся эта последовательность событий ведет к возрастанию степени a -спирализации молекул лизоцима именно потому, что по их ходу число А – А связей, – т.е. комплекса гидрофобных взаимодействий, строго упорядоченных в пространстве, – все время уменьшается и, следовательно, ючезают препятствия к возникновению системы водородных связей, формирующей a-спирали лизоцима. Напротив, возникновение неупорядоченных гидрофобных взаимодействий, наблюдающееся на второй стадии процесса – при вытеснении молекул диоксана из состава молекул лизоцима – возникновению a-спиралей не мешает.