6.5. Исследования необратимой тепловой денатурации белков
16 января 1996 года Курганов предложил мне новую тему – исследование необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Точнее, речь шла о математических методах анализа кривых ДСК. Приборы ДСК были во многих институтах. В Институте биохимии такой прибор был в группе Дмитрия Левицкого (лаборатория молекулярной организации биологических структур), с которым у нас были прекрасные отношения. И мы с ним эти проблемы часто обсуждали. Но вот обсчитать его данные у нас не получилось.
Другой прибор был в Институте физико-химической биологии им. Белозерского МГУ, работал на нем Виктор Орлов. Вот с Орловым нам удалось успешно сотрудничать, он сделал для нас ДСК трех ферментов. Также мы сотрудничали с Валерием Леонидовичем Шныровом, который в то время работал в Испании, в Университете Саламанки.
В то время наиболее подробно были разработаны математические модели обратимой тепловой денатурации белка. Однако, как показали исследования, тепловая денатурация многих белков носит необратимый характер. В то же время математические методы анализа кривых ДСК для случаев необратимой денатурации белка были развиты недостаточно.
Считалось, что тепловая денатурация белка может быть описана с помощью модели Ламри–Эйринга, которая включает последовательно протекающие одну обратимую и одну необратимую стадии. Эта модель включает в себя как частные случаи одностадийную обратимую денатурацию и одностадийную необратимую денатурацию. Другими частными случаями, которые мы исследовали, можно было считать модель Ламри–Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии и модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии.
14 февраля 1996 года я взял у Орлова файлы с кривыми ДСК по уридинфосфорилазе из Esherichia coli (этот фермент был выделен Анной Бурлаковой из Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов). Но обсчитать их мне удалось лишь несколько месяцев спустя. 21 февраля я начал работать над программой обсчета кривых ДСК.
Мы начали с самой простой, одностадийной модели необратимой денатурации. Эта модель ранее изучалась Jose M. Sanchez-Ruiz в Испании, в Университете Гранады. Он с соавторами предложил пять приближенных методов определения энергии активации процесса денатурации. Мы проанализировали эти методы и предложили еще три новых. Наиболее точным оказался один из предложенных нами методов, который предусматривает описание экспериментальных данных с помощью теоретического уравнения для зависимости избыточной теплоемкости от температуры. Эта процедура позволила найти сразу все три параметра процесса денатурации: изменение энтальпии, энергию активации и параметр Т* (это температура, при которой константа скорости равна единице). В отличие от многих других, данная процедура оказалась не чувствительна к флуктуациям в начальной и конечной части кривой. И наш метод позволил использовать большое число экспериментальных точек – практически все точки, получаемые с прибора. Это значительно повысило точность вычислений.
Для реализации данного метода я создал оригинальную компьютерную программу. Позже мы приобрели коммерческий программный пакет Scientist, который позволял проводить обработку экспериментальных данных непосредственно с помощью системы дифференциальных уравнений без ее аналитического решения. Результаты расчетов с помощью обеих программ совпадали с высокой степенью точности.
Мы предложили также критерии соответствия экспериментальных данных одностадийной модели. Разработанные нами подходы мы вначале опробовали на данных, которые получил Шныров с соавторами (кривые ДСК для трех белков: ацетилхолинэстеразы из Torpedo californica, целлюлазы из Streptomyces halstedii и лектина из чечевицы). Эти данные они описали в опубликованных статьях в рамках одностадийной необратимой модели с помощью методов, предложенных Санчез-Руизом. Но мы проверили эти данные нашими методами и нашли, что они плохо описываются одностадийной моделью.
Статью по результатам исследований я начал писать уже 17 апреля 1996 года. Но исследования продолжались, и статья постепенно менялась. 23 июля я отправил статью Шнырову. 25 сентября получили замечания Шнырова по статье. В ходе работы над статьей мы решили связаться с Санчез-Руизом и предложить ему соавторство. 11 ноября получили по факсу письмо от него и, учтя его замечания, стали дорабатывать статью. 26 декабря я отправил статью в журнал «Biophysical Chemistry». 31 марта 1997 года получили из редакции ответ с замечаниями, доработали ее, согласовали с соавторами, и 5 мая я отправил в редакцию исправленную статью.
Статья «Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation» (авторы Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L.) вышла в журнале «Biophysical Chemistry» в том же 1997 году. Она стала самой цитируемой моей публикацией в области физико-химической биологии и одной из наиболее цитируемых публикаций Курганова. По состоянию на март 2025 года в РИНЦ у нее насчитывается 117 ссылок, а в Google Scholar – 159.
В сентябре–октябре 1996 года я начал работу над другими моделями, в том числе моделью Ламри–Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии и моделью, включающей две последовательно протекающие необратимые стадии. Параллельно пытался анализировать данные Левицкого по миозину и данные Орлова по уридинфосфорилазе.
Важным шагом была модификация нашего метода. Дело в том, что обычно экспериментаторы снимают несколько кривых ДСК на разных скоростях сканирования. Вначале мы пытались обрабатывать каждую кривую в отдельности. Однако оказалось, что для двухстадийных моделей, где число параметров пять или шесть, одной кривой недостаточно для количественного анализа: точность оценки параметров оказывается невелика. Тогда я провел обработку всех кривых одновременно, модифицировав соответствующим образом свои компьютерные программы.
Этот подход я реализовал при анализе данных по уридинфосфорилазе. В результате оказалось, что из трех моделей только модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии, удовлетворительно описывает экспериментальные кривые.
11 января 1997 года я начал работать над статьей по уридинфосфорилазе. 25 февраля закончил расчеты, 7 апреля обсудили статью с Кургановым, 23 апреля передал русский текст статьи Бурлаковой, 24 апреля начал переводить ее на английский, 29 апреля обсудил статью с Орловым, 2 июня обсудил с Кургановым перевод и 17 июня отправил статью в журнал «Biophysical Chemistry». 9 сентября из редакции был получен ответ с замечаниями, мы доработали статью и отправили доработанный вариант в редакцию. Статья «Irreversible thermal denaturation of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12» (авторы Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Burlakova A.A., Orlov V.N.) вышла в журнале «Biophysical Chemistry» в 1998 году. В РИНЦ у нее насчитывается 36 ссылок, в Google Scholar – 38.
Параллельно мы решили опубликовать те же данные в виде краткой статьи в журнале «Доклады Академии наук» (ДАН). В этом журнале статьи публиковались относительно быстро, без рецензии, но либо одним из авторов должен был быть академик или член-корреспондент РАН, либо статья должна была быть представлена кем-то из них. Мы решили включить в соавторы директора института член-корреспондента Б.Ф. Поглазова. 23 апреля 1997 года я написал краткую статью для ДАН, 5 июня передали Поглазову статью, 10 июня Поглазов ее подписал, и 16 июня я отвез статью в редакцию. Статья «Изучение необратимой тепловой денатурации уридинфосфорилазы из Escherichia coli K-12 методом дифференциальной сканирующей калориметрии» (авторы Любарев А.Е., Курганов Б.И., Бурлакова А.А., Орлов В.Н., Поглазов Б.Ф.) вышла в журнале «Доклады Академии наук» тоже в 1998 году.
В ходе поездки в Китай в сентябре 1997 года (см. подраздел 5.3) мы получили от китайских коллег препарат креатинкиназы из скелетных мышц кролика. И я сразу начал передавать Орлову растворы препарата для его исследования методом ДСК.
Орлов снимал кривые ДСК вплоть до апреля 1998 года. Они хорошо укладывались в одностадийную модель. Еще в марте, не дожидаясь окончания эксперимента, я начал работать над статьей. Мы ее в мае согласовали с Х.М. Чжоу (нашим китайским соавтором), в сентябре внесли исправления, и 1 октября я отправил статью все в тот же журнал «Biophysical Chemistry». Статья «Two-state irreversible thermal denaturation of muscle creatine kinase» (авторы Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Orlov V.N., Zhou H.-M.) вышла в этом журнале в 1999 году. В РИНЦ у нее насчитывается 44 ссылки, в Google Scholar – 57.
Параллельно мы занимались обработкой кривых ДСК липазы, которые снимали Шныров и соавторы. 24 ноября 1997 года получили от Шнырова рукопись статьи по липазе, я сделал свои расчеты и 15 февраля 1998 года начал переделывать статью, в марте согласовывал статью с Кургановым и Шныровым. Статья «Irreversible thermal denaturation of lipase B from Candida rugosa» (авторы Shnyrov V.L., Martinez L.D, Roig M.G., Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Villar E.) вышла в 1999 году в журнале «Thermochimica Acta».
В это же время я занимался теоретическим анализом двух моделей. 29 сентября 1997 года начал работать над двухстадийной моделью. 7 октября начал писать по этой модели статью, согласовал ее с Кургановым и 13 ноября передал в редакцию журнала «Биохимия», еще через месяц передал туда исправленный вариант. Статья «Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. I. Модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии» вышла в 1998 году в апрельском номере этого журнала. В РИНЦ у нее 34 ссылки, в Google Scholar – 37.
22 сентября 1998 года начал работать над расчетами и статьей по полной кинетической модели Ламри–Эйринга. 28 октября передал Курганову, обсудили ее, и 13 ноября сдал статью в редакцию. Статья «Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. II. Полная кинетическая модель Ламри-Эйринга» вышла в 1999 году в июльском номере журнала «Биохимия».
Эти же материалы я докладывал несколько раз. 17 декабря 1997 года у меня был стендовый доклад «Математические модели необратимой тепловой денатурации белка и анализ данных дифференциальной сканирующей калориметрии» на конференции, посвященной 30-летию журнала «Молекулярная биология» (тезисы опубликованы в этом журнале в № 2 за 1998 год). На симпозиуме по денатурации и фолдингу белка в июне 1998 года в Москве (см. подраздел 7.3) у меня был стендовый доклад «Mathematical models of thermal protein denaturation and analysis of differential scanning calorimetry data», но у меня не было времени к своему стенду подойти. 1 декабря 1998 года я сделал доклад на конкурсе научных работ ИНБИ, и моя работа получила третье место.
