Меклер Л.Б., Идлис Р.Г.
Москва 1981
Построение трехмерных молекул биологических полипептидов и нуклеопротеидов. Общие соображения
Цель данной работы – воспроизведение в модели процесса образования трехмерных молекул полипептидов и нуклеопротеидов, происходящего непосредственно в клетках, а не в системе
in vitro. Очевидно, что для этого, чтобы достичь этой цели, надо, по крайней мере, знать, как трехмерные молекулы полипептндов строятся в клетке – непосредственно по ходу их синтеза или после завершения синтеза полипептидных цепей. К сожалению, однозначного ответа на данный вопрос пока не имеется (см., например, [1, 17, 72 стр. 225, 73 стр. 63, 74 стр. 385, 75–77]). Мы полагаем, что верна первая точка зрения [72, 73, 75–77], а вторая – следствие принципиально ошибочной интерпретации результатов двух широко известных экспериментов, но поставленных в свое время Анфинсеном и др. [78, 79] с целью изучения процессов ренатурации белков, и экспериментов и расчетов, проведенных Л.Полингом и Р.Кори [80, 81] и обнаруживших в составе ряда белков структуры, названные ими a -спиралями и b -структурами. Анализ процесса образования биологических полипептидов, основой которого являются модели упомянутых пяти белков, построенных согласно данному коду, приводит к выводу, что в реальных трехмерных молекулах полипептидов, синтезируемых полирибосомами, не существует ни a -спиралей с шагом 3,6, ни b -структур типа описанных Полингом и Кори [80, 81]. И первые, и вторые образуются, скорее всего, только при кристаллизации полипептидов (белков) в результате уплотнения их молекул, происходящего при кристаллизации. В связи с этим нельзя не обратить внимания на тот факт, что истинные параметры спиральных структур, обнаруженные в глобулярных белках и называемых a -спиралями, отличаются от теоретических, рассчитанных Полингом и Кори (см., например, [82]), как и на то обстоятельство, что и a -спирали, и (b -структуры были обнаружены Полингом и Кори при анализе естественных кристаллических структур белков — нитей a -кератина [81, 82].Действительно, трехмерные молекулы полипептидов, как и их линейные молекулы, – первичные структуры – в высшей степени индивидуальны, а принцип построения моделей a
-спиральных сегментов и b -структур по Полингу и Кори полностью лишает эти сегменты молекул индивидуальности. Хорошо известно, что любому полипептиду индивидуальность придает индивидуальность последовательности его аминокислотных остатков. Поэтому индивидуальность построения трехмерной молекулы полипептида и воспроизводимость повторения этой индивидуальности может быть следствием только последовательного специфического узнавания друг другом боковых групп аминокислотных остатков полипептидной цепи. А – А код и лежит в основе реализации этой специфичности.Выше мы, однако, видели, что и А – А код, и А – Н код вырождены в такой же степени, как и генетический код. И это не удивительно, ибо эти коды взаимосвязаны. Чем же обеспечивается избирательность, совершенно необходимая для построения однозначной, воспроизводимой трехмерной молекулы биологического полипептида? Ясно, что однозначность может достигаться только при узнавании друг другом очень коротких фрагментов полипептидных цепей, построенных из таких аминокислотных остатков, которые могут связываться друг с другом только однозначным образом. В свою очередь, такая ситуация возможна только в таком случае, когда трехмерная молекула полипептида начинает формироваться сразу же после синтеза небольшого олигопептида и продолжается дискретными стадиями, следующими друг за другом после синтеза очередного олигопептида сходной длины.
Какова же длина такого минимального олигопептида? Построение простых трехмерных моделей показало, что его длина не может быть меньше четырех аминокислотных остатков. Возможность увеличения его длины определяется конкретный составом взаимодействующих олигопептидов и, судя по имевшемуся небольшому опыту, за редкими исключениями, не превышает пяти–семи. Эта величина близка найденной Де Коэном [85] расчетным путем по методу Ликвори [86]. Эти
расчеты показали, что полипептидная цепь, состоящая из шести аминокислотных остатков, приобретает вполне устойчивую конформацию, в результате чего дальнейшее увеличение длины полипептида уже не изменяет конформации уже сформировавшейся его части.Сказанное выше означает, что понятие "вторичная структура белков" лишено биологического смысла. Действительно, если верно то, о чем говорится в данной статье, в клетках почти одновременно, с крайне незначительным латентным периодом, формируется и первичная, и трехмерная структура полипептида. Не говоря уже о построенных нами трехмерных моделях упомянутых пяти белков, в пользу справедливости данного утверждения свидетельствует хотя бы тот факт, что в клетках простетические группы присоединяются к молекуле белка только в строго определенный момент синтеза его полипептидной цена. Так, блокирование функции ферментов, катализирующих этот процесс, следствием чего является десинхронизация его с процессом синтеза полипептидной цепи, приводит к синтезу белка, лишенного простетических групп. Принципиально важно, что в условиях, подобных существующим в клетках, к этим белкам простетические группы впоследствии присоединить уже не удается. Эти факты свидетельствуют о том, что
упомянутые ферменты узнают строго определенные участки молекулы белка, имеющиеся на его поверхности лишь тогда, когда она еще не полностью синтезирована (см., например, [87]). Все это приводит к мысли, что полная ренатурация достаточно длинных сегментов денатурированных белков в растворе, вопреки многочисленным утверждениям (см., например, [72, 74, 79]) не происходит. Нативная молекула белка, денатурированная до состояния линейной молекулы, спонтанно, без искусственного создания в растворе условий, подобных существующим у полирибосомы, не может возвратиться в исходное состояние (см., например, [26], стр. 394). Ответ на вопрос о том, каковы эти условия, – содержание другой статьи.Каковы же критерии, которым следует удовлетворить, чтобы убедиться, что построение модели согласно данному коду идет правильно? Как упоминалось выше, принято считать, что безусловным эталоном должны быть модели, построенные по результатам рентгеноструктурного анализа. Мы, однако, считаем, что для тех целей, которые сформулированы в начале данной статьи, модели, строящиеся по данным рентгеноструктурного анализа, должны служить не эталоном, а лишь одним из критериев справедливости строящихся моделей динамичных молекул белков, синтезируемых в клетке. Ибо, поскольку многие белки находятся в растворе в виде популяций стереоизомеров [44, 116], не приходится и говорить, что идентичность кристаллической структуры белков, кристаллизуемых из различных растворителей и в различных условиях, как это принято считать [116], стр. 26, [20], стр. 21, является свидетельством идентичности конформации белка в растворе и в кристалле.
Как же следует использовать данные рентгеноструктурного анализа для оценки справедливости моделей, строящихся по данному коду? На наш взгляд, этот ответ состоит в том, чтобы суметь, исходя из совокупности знаний о свойствах белков и данного кода, провести преобразование, ведущее к преобразованию молекул белков, находящихся в растворе, в молекулы кристалла, т.е. описать процесс кристаллизации белка в рамках соответствующего изменения конформации молекул белков. Ниже мы формулируем наше понимание процесса кристаллизации белков, из которого следует исходить при решении этой задачи.
1. Утверждается, что на поверхности любой трехмерной белковой молекулы имеются линейные кольцеобразные структуры, представляющие собой олигопептидные сегменты общей цепи длиной 6–12 аминокислотных остатков. Эти структуры являются сенсорными органами молекулы, воспринимающими сигналы, поступающие к молекуле из внешней среды, и передающими эти сигналы к внутренней части молекулы, результатом чего и является ее соответствующее конформационное превращение. Иммунологически эти кольцевые структуры выявляются как антигенные детерминанты молекулы.
2. Утверждается, что в составе любого антигенного детерминанта, как правило, должны встречаться как полярные, так и неполярные аминокислотные остатки. Это условие является обязательным для образования А–А связей при взаимодействии антигенных детерминантов различных молекул друг с другом.
3. Утверждается, что любой антигенный детерминант представляет собой кольцевую линейную структуру, минимум 60–70% аминокислотных остатков которой свободно, а остальные 30–40% связаны кодовыми связями с аминокислотными остатками самой молекулы, находящимися внутри ее. В пользу справедливости этого утверждения говорят результаты, полученные при изучении перекрестных иммунологических реакций между миоглобинами различных видов животных [117].
4. Кодовые связи, имеющиеся в любой молекуле биологического полипептида, в принципе можно разделить на две группы: к первой относятся связи, образуемые аминокислотными остатками антигенных детерминантов с другими аминокислотными остатками молекулы. Ко второй – все остальные, т.е. те, которые стабилизируют трехмерную конфигурацию молекулы.
5. Утверждаются, что при узнавании белками друг друга, в том числе и при узнавании, ведущем к кристаллизации белка, узнающими и взаимодействующими структурами являются именно антигенные детерминанты.
6. Утверждается, что эта часть процесса взаимодействия молекул является лишь первой его стадией. Вторая стадия состоит в перестройке системы кодовых контактов, стабилизирующих остов. В результате число кодовых связей, образующихся между различными молекулами кристалла, возрастает до некоторого максимума
, а число кодовых связей, остающихся внутри остова, уменьшается до некоторого минимума. Т.е., решетка кристалла, построенного по кодовым связям, в принципе, отличается от решетки, которая бы получилась, если бы молекулы, образующие кристалл, были бы сдвинуты друг относительно друга настолько, чтобы контакты между антигенными детерминантами соседних молекул были бы невозможны. В пользу справедливости этого утверждения свидетельствует строение молекул белков, обнаружившееся в результате построения их моделей согласно А – А коду.7. Распад кодовых связей между аминокислотными остатками второй группы, упомянутой в пункте 4, создает ситуацию, приводящую к образованию водородных связей, формирующих a -спирали и b -структуры. Речь идет о распаде системы флуктуации в результате образования А – А связи с антигенным детерминантом другой молекулы аминокислотным остатком данного детерминанта, входящего в систему упомянутой флуктуации (см. стр. 40).
8. Поскольку образование каждой кодовой связи ведет к выделению энергии порядка 6–10 ккал/моль, система кодовых связей, определяющих решетку кристалла белка, является энергетически более выгодной, чем система водородных связей, ответственных за образование системы a -спиралей и b -структур. Сказанное означает, что при плавлении кристалла белка сначала должно наблюдаться плавление внутренней структуры молекулы белка при сохранении положения в кристалле каждой молекулы белка, а следовательно, и самой формы кристалла. Именно этот феномен, предсказываемый данной теорией, наблюдается
в эксперименте [118–120], а не распад кристалла на отдельные молекулы в результате его нагревания, как должно было наблюдаться, если бы строение белка, находящегося в растворе, и в составе кристалла, было бы действительно идентичным, как принято думать.Хорошо известно, что первичная структура полипептида, имеющего в своем составе остатки цистеина, определяет не только положение их в полипептидной цепи, но и порядок взаимодействия между ними, задающий положение в трехмерной молекуле
S–S связей. Поэтому первым критерием справедливости строящейся модели молекулы полипептида является соответствие положения образующихся S–S связей положению реально существующих в молекуле. Ибо ясно, что случайно такое соответствие возникнуть не может.При построении моделей молекул лизоцима, миоглобина и инсулина вторым критерием соответствия моделей реальным молекулам служило совпадение строения и взаимного расположения антигенных детерминантов с ранее установленным методами иммунохимии и рентгеноструктурного анализа.
Третий критерий, который мы использовали, стал ясен по ходу самой работы. Мы назвали его критерием связности рядов. Сущность его состоит в следующем. По ходу работы мы обнаружили, что синтезирующаяся полирибосомами полипептидная цепь, судя по моделям, которые мы строили, наматывается сама на себя, образуя спирали того или иного шага, от 4 до 16–18. Оказалось, что в некоторых вертикальных рядах этих спиралей располагаются стереокомплементарные и стереоэквивалентные аминокислотные остатки, относящиеся к одной какой-либо компоненте связности. Поскольку молекулы стереоэквивалентных аминокислот по самому определению обладают участками сходной конфигурации, мы интерпретировали этот феномен как указание на тот факт, что расположение аминокислотных остатков в вертикальном
ряду по принципу подобного с подобным тоже, хотя и в меньшей степени, чем образование А –А связей, энергетически выгодно, что наводит на мысль о том, что такие сегменты полипептидных спиралей формируются по законам роста кристаллов. Знание этого факта оказало нам большую услугу, ибо модели, которые мы строим, демонстрируют лишь порядок взаимосвязи друг с другом соответствующих аминокислотных остатков, а не строгое положение в пространстве всех атомов молекулы пептида, что может привести к неоднозначностям, вызванным не принципиальными особенностями метода, а конкретной, доступной нам техникой его реализации. Поэтому, когда в процессе построения модели возникали неоднозначности в порядке укладки очередного сегмента полипептидной цепи, то, выбирая предпочтительный вариант, мы учитывали не только связи, образуемые по А – А коду, но и использовали критерий связности вертикальных рядов.Четвертым критерием верности служило совпадение получаемого результата с теми, которые были получены при помощи рентгеноструктурного анализа. Мы имеем в виду как совпадение общего хода полипептидной цепи, так и конкретного взаимного расположения в пространстве тех или иных аминокислотных остатков, достаточно удаленных друг от друга по первичной структуре.
И, наконец, пятым критерием, который мы
используем, является оценка возможности реализации молекулой, подобной построенной модели, тех физиологических функций, которые данный белок выполняет.Как мы увидим далее, после сформирования половины – двух третей молекулы полипептида, – в случае лизоцима и белка-репрессора почти точно половины – растущий далее конец полипептидной цепи изменяет направление движения на противоположное, т.е. направляется к
NH2-концу молекулы. (У лизоцима этот поворот совершается у цис-64, а у cro – у асн-31). Этот процесс совершается таким образом, что сначала растущая цепь идет вдоль предыдущей, а затем, на определенной стадии, пересекает ее и далее движется между двумя ранее сформировавшимися цепями, подобно ведущему движку застежки молнии, разрывая связи, ранее образовавшиеся согласно А – А коду между их аминокислотными остатками, но зато взамен образуя новые А – А связи между своими аминокислотными остатками, с одной стороны, и аминокислотными остатками то верхней, то нижней цепи, с другой. При синтезе молекулы лизоцима СООН-конец цепи приходит почти к NH2-концу, на чем синтез трехмерной молекулы полипептида и завершается, а при синтезе репрессора из-за того, что по дороге к NH2-концу цепь дважды перепрыгивает с нижних цепей на верхние, ближайшим к NН2-концу оказывается не ала-66, а ала-46, после чего цепь, двигаясь по принципу молнии, совершает еще два поворота на 180°, в результате чего и формируется характерная крабовидная форма молекулы cro. В этих случаях и направляющая, и направляемая части полипептидной цепи остаются в составе трехмерной молекулы полипептида.Второй вариант имеет место при синтезе молекулы проинсулина – инсулина. В этом случае до поворота цепи в противоположную сторону синтезируется В-цепь инсулина и примерно две трети пептида, который после сформирования целостной молекулы проинсулина отщепляется протеазами, что и ведет к превращению проинсулина в инсулин. Двигаясь по принципу молнии в обратном направлении, этот пептид приводит первый аминокислотный остаток А-цепи инсулина в строго детерминированное положение ранее сформировавшейся В-цепи, после чего растущая А–цепь движется по В-цепи, формируя ту молекулу, которая и является инсулином, а связи, ранее образовавшиеся между В-цепью и пептидом–помощником, разрываются.
Наконец, соединенный со сформировавшейся молекулой инсулина лишь двумя ковалентными связями пептид–помощник отщепляется протеазой, на чем синтез трехмерной молекулы инсулина и завершается. Следовательно, принципиальным различием между вторим и первым вариантом синтеза трехмерной молекулы полилептида является отщепление во втором варианте ведущего цепь пептида–помощника от готовой молекулы. Следует, однако, подчеркнуть, что и в первом, и во втором варианте организующим центром, вокруг которого укладывается растущая полипептидная цепь, является глобула, сформировавшаяся раньше из уже синтезированной полипептидиой цепи.
Иная, третья, ситуация, наблюдается при формировании трехмерной молекулы миоглобина. В этом случае по мере формирования трехмерной молекулы также образуются спирализованные сегменты-домены, шаг которых, за одним исключением, ступенчато возрастает. Однако третий спирализованный сегмент-домен молекулы миоглобина формируется не вокруг ранее сформировавшихся двух цилиндрообразных доменов, а вокруг молекулы гема,
в данном случае выполняющего роль организующего центра домена. Можно полагать, что именно благодаря этому обстоятельству гем регулирует синтез гемоглобина. Связываясь с синтезируемой полипептидной цепью, гем в результате, подобно любой простетической группе, модифицирует полипептидную цепь, что исключает возможность приобретения ею той единственной конформации, в которой она может репрессировать кодирующий ее ген по принципу перекрестной комплементарности (показано, что блокирование синтеза гема ведет к репрессии синтеза a цепи гемоглобина [88]).Ясно, что эта стратегия построения моделей трехмерных молекул биологических полипептадов в принципе отличается от используемой при построении моделей трехмерных молекул белков в соответствий с идеей Анфинсена [1–26], согласно которой [78, 79] конформация любого нативного белка отвечает минимуму его свободной энергии. Результаты многочисленных экспериментов свидетельствуют, что подавляющее число белков, а скорее всего, все белки без исключения, денатурированные до полного развертывания полипептидной цепи, при ренатурации никогда не восстанавливают всех своих свойств, и даже полное восстановление их функциональной активности вовсе не означает, что конформация ренатурированного белка идентична конформации белка нативного (см., например, [26], стр. 394). В качестве примера полного восстановления трехмерной структуры белка при ренатурации обычно ссылаются на ренатурацию миоглобина
[89]. Между тем, как свидетельствуют результаты недавно проведенных исследований [90], полное восстановление функциональной активности миоглобина и гемоглобинов, наблюдающееся при такого рода экспериментах, вовсе не означает возвращение ренатурированного белка к нативной конформации. Действительно, изучение денатурированного гемоглобина человека иммунохимическими методами – его b и g -цепей – демонстрирует, что пространственная конфигурация ренатурированных цепей совпадает с пространственной конфигурацией нативных цепей не больше, чем на 85%, а этого вполне достаточно, чтобы такого рода белки воспринимались организмом как чужеродные.Сказанное означает, что построение моделей трехмерных молекул нативных белков, исходя из моделирования ренатурации полностью денатурированного полипептида, в принципе невозможно. Общее теоретическое решение подобной задачи всегда будет поливариантным, а моновариантным является лишь решение, отвечающее процессу, реализуемому в
живой клетке, – последовательному, сегментарному свертыванию полипептида, начиная с его NH2-конца. Именно поэтому попытки применения генной инженерии на основе микроорганизмов для получения нативных белков эукариотов не имеет никаких шансов на успех [91–94].Титульный лист | Физико-химическая биология | Меклер
