Во всем виноваты интермедиаты

Еще в 1970-е гг. М.Гольдберг в Пастеровском институте в Париже, изучая восстановление исходной структуры (ренатурацию) химотрипсиногена (неактивного предшественника фермента химотрипсина – фермента, участвующего в переваривании белков) после денатурации, т.е. разворачивания полипептидной цепи белка под действием температуры или других факторов, обнаружил, что денатурированные молекулы химотрипсиногена зачастую образовывали агрегаты.

Дальнейшие исследования показали, что при контакте частично свернутых молекул (интермедиатов) они склеивались раньше, чем завершался процесс сворачивания. Выход нормального белка повышался при понижении концентрации белка в растворе, т.е. при уменьшении вероятности контакта между частично свернутыми молекулами. “Это навело нас на мысль, – говорит Гольдберг, что образование агрегатов было... не результатом формирования плохо свернутого белка”. Эксперименты с бактериальным ферментом триптофаназой показали, что частично денатурированный белок образует агрегаты только сам с собой, но не с другими белками.

Так были получены первые доказательства специфичности агрегации белка. Однако на две статьи (1974 и 1978 гг.) М.Гольдберга с этими данными никто не обратил внимания, и только в последние годы исследования, начатые Гольдбергом, продолжили другие ученые.

В ряде экспериментов было показано, что даже очень малые изменения в аминокислотной последовательности могут либо способствовать агрегации, либо предотвращать ее. В 1981 г. при изучении белков оболочек бактериальных вирусов Д.Кинг и его коллеги по Массачусетскому технологическому институту (США) открыли мутации, которые делают фолдинг чувствительным к температуре. При одной из таких мутаций, которая изменяет лишь одну аминокислоту, белок нормально сворачивается при низких температурах, но при высоких температурах мутантные белки, в отличие от нормальных, образуют агрегаты. Это было сильным аргументом в пользу того, что фолдинг и агрегация определяются аминокислотной последовательностью и что за образование агрегатов отвечают специфические участки аминокислотной цепи.

В середине 1980-х гг. Д.Бремс и его коллеги из корпорации “Апджон” (США) обнаружили, что небольшие изменения в аминокислотной последовательности могут предотвращать агрегации. Так, замена всего одной аминокислоты в факторе роста крупного рогатого скота полностью устраняет агрегацию, не влияя на фолдинг. Следовательно, агрегация белка вызывается не просто “неспецифическим беспорядком”, как думали раньше.

Как образуются амилоиды

Вслед за работами Бремса, Кинга и др., Рон Вецел из фармацевтической компании “Смит-Клайн” и Джеффри Келли из Техасского университета (США) начали исследования с целью понять, что вызывает образование аномальных белковых отложений при амилоидных болезнях. Для своих опытов Келли выбрал один из наиболее изученных образующих амилоид белков – транстиретин – обычно присутствующий в плазме крови. Будучи измененным в результате какой-либо мутации, он откладывается в сердце, легких и кишечнике, вызывая семейную амилоидную полиневропатию, жертвы которой в конечном итоге умирают от дисфункции органа.

Транстиретин является тетрамером, состоящим из четырех идентичных белковых цепей. В кислой среде в пробирке эти мономеры отделяются друг от друга. Затем они частично разворачиваются, выставляя наружу определенные аминокислотные остатки, после чего легко связываются с аналогичными цепями других мономеров. Образующиеся при этом агрегаты очень похожи на амилоидные транстиретиновые отложения.

Мутантные белки гораздо легче нормальных диссоциируют на отдельные полипептидные цепи с частично развернутой структурой и образуют амилоиды.

Нечто аналогичное происходит также в случае двух других амилоидных болезней, известных как амилоидоз и болезнь отложения легких цепей. Эти заболевания, как и семейная амилоидная полиневропатия, относительно редки: они поражают одного из 10–100 тыс. человек. Но агрегация частично развернутых белков может быть причиной и наиболее распространенного амилоидного заболевания – болезни Альцгеймера, от которой только в США страдают 4 млн человек. Однако способ образования амилоида при этом заболевании может отличаться от того, который установлен для семейной амилоидной полиневропатии.

Прион – новый тип возбудителя болезней

Прионы, по-видимому, существуют в двух формах, одна из которых нормально свернута, а другая агрегирована в амилоидоподобные отложения. Исследователи предположили, что когда этот аномальный белок приходит в контакт с нормальным, он может переводить и его в аномальную форму. Это объясняет, каким образом попадание аномального белка в мозг может индуцировать амилоидные отложения и дегенерацию мозга у инфицированных животных.

Первоначально против прионовой гипотезы было выдвинуто одно серьезное возражение: существуют различные типы инфекционных агентов, вызывающих несколько различающиеся, например, по инкубационному периоду, заболевания. Инфекционные агенты каждого типа при размножении точно воспроизводятся от поколения к поколению и от животного к животному, и такую способность, казалось, трудно объяснить, если инфекционные агенты не имеют генома.

ДОПОЛНЕНИЕ

Стэнли Прусинеру была присуждена Нобелевская премия 1997 г. по физиологии и медицине “за открытие прионов – нового биологического принципа инфекции”.

Прусинер родился в 1942 г. В 1968 г. он окончил медицинскую школу Пенсильванского университета в Филадельфии и поступил в интернатуру Калифорнийского университета в Сан-Франциско. С тех пор вся его научная деятельность связана с Калифорнийским университетом. Сейчас нобелевский лауреат занимает в этом университете должности профессора нейрологии, вирусологии и биохимии.

Работа, приведшая к открытию, началась в 1972 г., когда один из пациентов Прусинера умер от болезни Крейтцфельдта–Якоба. В то время уже было известно, что эта болезнь, так же как “куру” и ряд заболеваний животных, может передаваться с экстрактом мозга больного. Существовало несколько гипотез о природе возбудителя болезней, среди которых была и гипотеза, предполагавшая, что инфекционный агент не содержит нуклеиновой кислоты. Но такая точка зрения не принималась всерьез, так как трудно было поверить, что возбудитель не содержит наследственное вещество. Наиболее распространенной была теория “медленных вирусных инфекций” (все болезни характеризуются длительным инкубационным периодом). Но найти вирус не удавалось.

В последние годы работы Прусинера получили широкое признание: начиная с 1991 г. он получил более 10 наград в США, Германии, Израиле и Японии. И вот – вполне заслуженная Нобелевская премия.

Прионовые болезни животных и человека

“Коровье бешенство” (губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота). В Англии коровы были заражены ею благодаря тому, что в их рацион попали потроха овец, больных “скрепи”. Эпидемия возникла в 1985 г., но из-за длительного инкубационного периода она достигла пика лишь к 1992 г. К настоящему времени “коровьим бешенством” оказались поражены 37 тысяч животных.

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба – этим заболеванием поражено около миллиона человек. В 85–90% случаев было показано, что болезнь возникла спонтанно. В 10–15% случаев заболевание вызывалось мутацией гена, кодирующего прионовый белок. В редких случаях причиной болезни была инфекция, передаваемая через препараты гормона роста, полученные из гипофиза больных, или трансплантаты мозга. Известно около 100 семей, являющихся носителями мутаций, вызывающих эту болезнь. От первых симптомов болезни до смерти проходит около одного года.

Новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба происходит, вероятно, от “коровьего бешенства”. С 1995 г. подобное заболевание выявлено примерно у 20 пациентов.