ПРИЧИНА МНОГИХ БОЛЕЗНЕЙ – НЕПРАВИЛЬНОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКА

Тот, кто любит рыться в старых вещах или книгах, знает, что всегда есть шанс найти среди хлама сокровище. Недавно так и случилось со специалистами, изучающими белки. Несколько десятилетий назад было обнаружено, что белки в растворе имеют неприятную тенденцию образовывать нерастворимые агрегаты. Эти агрегаты исследователи воспринимали как отбросы, грязь, от которой каждый хотел избавиться. Но теперь оказалось, что изучение этих отбросов может оказаться весьма полезным.

В последние годы стало понятно, что агрегация белков в пробирке очень похожа на образование так называемых амилоидных отложений в тканях. Эти отложения являются признаками дюжины различных заболеваний, из которых самое известное – болезнь Альцгеймера, сопровождающаяся общим расстройством памяти пожилом возрасте.

Общеизвестно, что белок представляет длинную цепь аминокислот – полипептидную цепь. У нормальных активных белков (т.е. белков в нативном состоянии) она не линейна, а свернута в специфическую трехмерную структуру. Процесс сворачивания полипептидной цепи называют фолдингом (от англ. folding – складывание, сворачивание). Исследования показала, что как агрегация белка в пробирке, так и образование амилоидных отложений происходят при дефектах фолдинга: неполностью свернутые молекулы сцепляются друг с другом и образуют нерастворимые волокнистые агрегаты. В лаборатории такие агрегаты – просто неприятность, но в живых тканях их формирование может оказаться фатальным.

Интерес к изучению белковых агрегатов возник не у химиков, занимающихся белками, и не у специалистов по амилоидным болезням, а у биотехнологов. Химики оказались в плену догмы “одна последовательность – одна структура”, основанной на работе К.Анфинсена (1960), за которую он был удостоен Нобелевской премии в 1972 г. Анфинсен показал, что трехмерная структура белка принимает в растворе полностью определяется его аминокислотной последовательностью.

В конце 70-х гг. при получении с помощью бактерий таких ценных белков, как фактор роста человека и инсулин, было обнаружено, что не так-то просто получить белки с правильной трехмерной структурой. Часто белки – посторонние для бактериальной клетки – слипались вместе, образуя нерастворимые “тела включения”, т.е. агрегаты белков в виде аморфной массы. Поскольку нормальную активность белки проявляют только тогда, когда они имеют правильную трехмерную структуру, биотехнологам было важно разобраться, почему образуются тела включения и как можно предотвратить их образование.

Во всем виноваты интермедиаты

Еще в 1970-е гг. М.Гольдберг в Пастеровском институте в Париже, изучая восстановление исходной структуры (ренатурацию) химотрипсиногена (неактивного предшественника фермента химотрипсина – фермента, участвующего в переваривании белков) после денатурации, т.е. разворачивания полипептидной цепи белка под действием температуры или других факторов, обнаружил, что денатурированные молекулы химотрипсиногена зачастую образовывали агрегаты.

Дальнейшие исследования показали, что при контакте частично свернутых молекул (интермедиатов) они склеивались раньше, чем завершался процесс сворачивания. Выход нормального белка повышался при понижении концентрации белка в растворе, т.е. при уменьшении вероятности контакта между частично свернутыми молекулами. “Это навело нас на мысль, – говорит Гольдберг, что образование агрегатов было... не результатом формирования плохо свернутого белка”. Эксперименты с бактериальным ферментом триптофаназой показали, что частично денатурированный белок образует агрегаты только сам с собой, но не с другими белками.

Так были получены первые доказательства специфичности агрегации белка. Однако на две статьи (1974 и 1978 гг.) М.Гольдберга с этими данными никто не обратил внимания, и только в последние годы исследования, начатые Гольдбергом, продолжили другие ученые.

В ряде экспериментов было показано, что даже очень малые изменения в аминокислотной последовательности могут либо способствовать агрегации, либо предотвращать ее. В 1981 г. при изучении белков оболочек бактериальных вирусов Д.Кинг и его коллеги по Массачусетскому технологическому институту (США) открыли мутации, которые делают фолдинг чувствительным к температуре. При одной из таких мутаций, которая изменяет лишь одну аминокислоту, белок нормально сворачивается при низких температурах, но при высоких температурах мутантные белки, в отличие от нормальных, образуют агрегаты. Это было сильным аргументом в пользу того, что фолдинг и агрегация определяются аминокислотной последовательностью и что за образование агрегатов отвечают специфические участки аминокислотной цепи.

В середине 1980-х гг. Д.Бремс и его коллеги из корпорации “Апджон” (США) обнаружили, что небольшие изменения в аминокислотной последовательности могут предотвращать агрегации. Так, замена всего одной аминокислоты в факторе роста крупного рогатого скота полностью устраняет агрегацию, не влияя на фолдинг. Следовательно, агрегация белка вызывается не просто “неспецифическим беспорядком”, как думали раньше.

В то же время было показано, что у клеток есть механизмы предотвращения агрегации вновь синтезированных белков, еще не приобретших нативной структуры. Оказалось, что клетки содержат специальные белки, которые связываются с вновь образованными белковыми цепями и предотвращают дефекты фолдинга. Такие белки получили название молекулярных шаперонов (от англ. и франц. chaperon – компаньонка, сопровождающая молодую девушку).

Шапероны “мешают интермедиатам фолдинга попадать в состояние, из которого нет возврата, говорит Кинг, – когда же белки млекопитающих образуются в бактериальных клетках, интермедиаты фолдинга агрегируют, так как бактерии не содержат нужных шаперонов, чтобы защитить их”.

Как образуются амилоиды

Вслед за работами Бремса, Кинга и др., Рон Вецел из фармацевтической компании “Смит-Клайн” и Джеффри Келли из Техасского университета (США) начали исследования с целью понять, что вызывает образование аномальных белковых отложений при амилоидных болезнях. Для своих опытов Келли выбрал один из наиболее изученных образующих амилоид белков – транстиретин – обычно присутствующий в плазме крови. Будучи измененным в результате какой-либо мутации, он откладывается в сердце, легких и кишечнике, вызывая семейную амилоидную полиневропатию, жертвы которой в конечном итоге умирают от дисфункции органа.

Транстиретин является тетрамером, состоящим из четырех идентичных белковых цепей. В кислой среде в пробирке эти мономеры отделяются друг от друга. Затем они частично разворачиваются, выставляя наружу определенные аминокислотные остатки, после чего легко связываются с аналогичными цепями других мономеров. Образующиеся при этом агрегаты очень похожи на амилоидные транстиретиновые отложения.

Мутантные белки гораздо легче нормальных диссоциируют на отдельные полипептидные цепи с частично развернутой структурой и образуют амилоиды.

Нечто аналогичное происходит также в случае двух других амилоидных болезней, известных как амилоидоз и болезнь отложения легких цепей. Эти заболевания, как и семейная амилоидная полиневропатия, относительно редки: они поражают одного из 10–100 тыс. человек. Но агрегация частично развернутых белков может быть причиной и наиболее распространенного амилоидного заболевания – болезни Альцгеймера, от которой только в США страдают 4 млн человек. Однако способ образования амилоида при этом заболевании может отличаться от того, который установлен для семейной амилоидной полиневропатии.

При болезни Альцгеймера мозг людей с поражением памяти усеян бляшками – аномальными структурами, которые имеют оболочку из амилоидных отложений. Нейробиологи многие годы спорят, действительно ли отложения, которые состоят в основном из волокон небольшого белка, называемого b-амилоидом, вызывают нейрональную дегенерацию Альцгеймера, или это вторичный результат разрушения нервных клеток. Работы, появившиеся 5 лет назад, показывают, что отложения b-амилоида, скорее всего, первичны.

b-амилоид, который содержит около 40 аминокислот, образуется из более крупного белка-предшественника амилоида (БПА). В 1991 г. исследователи во главе с нейрогенетиком Дж.Харди (Великобритания) обнаружили, что наследственная форма болезни Альцгеймера вызывается мутацией в БПА, но не было известно, что вызывает дегенерацию мозга.

Впоследствии Д.Селкоэ (США) и С.Янкин (США) показали, что БПА расщепляется, образуя b-амилоид, у всех людей. Мутации же, как обнаруженная Харди, так и другие, открытые позже у страдающих болезнью Альцгеймера, усиливают образование b-амилоида. Предполагают, что этого избытка b-амилоида достаточно для образования отложений, так как при высокой концентрации белка больше вероятность агрегации –аналогично тому, как это было в опытах Гольдберга.

Прион – новый тип возбудителя болезней

Возможно, аномалии фолдинга являются причиной и группы загадочных болезней, включающей почесуху (“скрепи”) овец, коровье бешенство и болезнь Крейтцфельдта–Якоба у людей. В течение многих лет вирусологи думали, что эти заболевания, которые характеризуются амилоидными отложениями в мозге и приводят к сумасшествию, вызываются медленно действующими вирусами. Однако идентифицировать патогенный вирус не удалось, и многие исследователи согласились с точкой зрения, высказанной Стэнли Прусинером из Калифорнийского университета (Сан-Франциско, США), что инфекционные частицы, которые Прусинер назвал прионами, являются не вирусами, а чистыми белками, не содержащими никаких нуклеиновых кислот.

Прионы, по-видимому, существуют в двух формах, одна из которых нормально свернута, а другая агрегирована в амилоидоподобные отложения. Исследователи предположили, что когда этот аномальный белок приходит в контакт с нормальным, он может переводить и его в аномальную форму. Это объясняет, каким образом попадание аномального белка в мозг может индуцировать амилоидные отложения и дегенерацию мозга у инфицированных животных.

Первоначально против прионовой гипотезы было выдвинуто одно серьезное возражение: существуют различные типы инфекционных агентов, вызывающих несколько различающиеся, например, по инкубационному периоду, заболевания. Инфекционные агенты каждого типа при размножении точно воспроизводятся от поколения к поколению и от животного к животному, и такую способность, казалось, трудно объяснить, если инфекционные агенты не имеют генома.

Прусинер и другие исследователи предположили, что различия в типах (линиях) инфекционных агентов могут быть связаны с различными конформациями прионовых белков. В 1995 г. П.Лэнсбери и Б.Когей (США) получили данные в пользу этой идеи. Они смешали в пробирке очищенные прионовые белки из мозга хомяков, инфицированных двумя различными линиями прионов, и нормальный прионовый белок. Оказалось, что нормальный белок приобретает трехмерную структуру того аномального белка, с которым он контактировал. “Мы были изумлены, увидев, что в бесклеточной системе происходит очень точное и специфичное превращение”, – говорит Когей. Таким образом, главное возражение против прионовой теории было преодолено.

Получив доказательства того, что аномалии сворачивание белков ведут к амилоидным болезням, исследователи начали искать способы их лечения. Зная, как можно устранить агрегацию белка в пробирке, можно попробовать использовать эти же методы в терапии амилоидных болезней, включая, разумеется, болезнь Альцгеймера. Очевидный подход к предотвращению неправильного сворачивания – создание небольших молекул или белков, которые будут специфически связываться с интермедиатами, способными образовывать амилоиды, и предохранять их от агрегации. Именно такие лекарства и пытаются сейчас разработать биотехнологические и фармацевтические фирмы, но они пока не публикуют свои результаты из соображений коммерческой тайны. Если же данный подход окажется успешным, можно будет смело сказать, что отбросы на дне пробирки оказались ценным кладом.

ДОПОЛНЕНИЕ

Стэнли Прусинеру была присуждена Нобелевская премия 1997 г. по физиологии и медицине “за открытие прионов – нового биологического принципа инфекции”.

Прусинер родился в 1942 г. В 1968 г. он окончил медицинскую школу Пенсильванского университета в Филадельфии и поступил в интернатуру Калифорнийского университета в Сан-Франциско. С тех пор вся его научная деятельность связана с Калифорнийским университетом. Сейчас нобелевский лауреат занимает в этом университете должности профессора нейрологии, вирусологии и биохимии.

Работа, приведшая к открытию, началась в 1972 г., когда один из пациентов Прусинера умер от болезни Крейтцфельдта–Якоба. В то время уже было известно, что эта болезнь, так же как “куру” и ряд заболеваний животных, может передаваться с экстрактом мозга больного. Существовало несколько гипотез о природе возбудителя болезней, среди которых была и гипотеза, предполагавшая, что инфекционный агент не содержит нуклеиновой кислоты. Но такая точка зрения не принималась всерьез, так как трудно было поверить, что возбудитель не содержит наследственное вещество. Наиболее распространенной была теория “медленных вирусных инфекций” (все болезни характеризуются длительным инкубационным периодом). Но найти вирус не удавалось.

И вот в начале 80-х гг. Прусинеру удалось выделить возбудителя скрепи овец и доказать, что он является чистым белком. Прусинер назвал новый тип инфекционного агента прионом (prion, от англ. proteinaceous infectious particle – белковая заражающая частица). Первое время и это открытие воспринималось с большим скептицизмом. Но в течение нескольких последующих лет работы Прусинера и его коллег позволили раскрыть механизм инфекции.

В последние годы работы Прусинера получили широкое признание: начиная с 1991 г. он получил более 10 наград в США, Германии, Израиле и Японии. И вот – вполне заслуженная Нобелевская премия.

Прионовые болезни животных и человека

Скрепи (почесуха, scrapie) – болезнь овец, впервые описанная в Исландии в XVIII в. Перенесена в Шотландию в 1940-х гг. Аналогичное заболевание поражает и других животных, например, норок, кошек, оленей.

“Коровье бешенство” (губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота). В Англии коровы были заражены ею благодаря тому, что в их рацион попали потроха овец, больных “скрепи”. Эпидемия возникла в 1985 г., но из-за длительного инкубационного периода она достигла пика лишь к 1992 г. К настоящему времени “коровьим бешенством” оказались поражены 37 тысяч животных.

Куру (“смеющаяся смерть”) – болезнь, открытая в 1956 г. среди членов племени форе в Новой Гвинее. Свое название получила из-за периодически наступающего у больных бесконтрольного смеха. От появления первых симптомов до смерти проходит от 3 до 12 месяцев. Американский ученый Д.К.Гайдузек выяснил, что болезнь передавалась благодаря ритуалу погребения, в ходе которого аборигены съедали мозг умершего. За эту работу Гайдузек в 1976 г. был удостоен Нобелевской премии.

Болезнь Гертсманна-Штраусслера-Шейнкера – наследственное заболевание, вызываемое мутацией гена, кодирующего прионовый белок человека. Выявлено примерно 50 семей с подобными мутациями. От появления первых симптомов до смерти может пройти от 2 до 6 лет.

Фатальная семейная бессонница – вызывается другой мутацией гена, кодирующего прионовый белок человека. Носители такой мутации обнаружены в 9 семьях. От первых симптомов до смерти проходит около одного года.

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба – этим заболеванием поражено около миллиона человек. В 85–90% случаев было показано, что болезнь возникла спонтанно. В 10–15% случаев заболевание вызывалось мутацией гена, кодирующего прионовый белок. В редких случаях причиной болезни была инфекция, передаваемая через препараты гормона роста, полученные из гипофиза больных, или трансплантаты мозга. Известно около 100 семей, являющихся носителями мутаций, вызывающих эту болезнь. От первых симптомов болезни до смерти проходит около одного года.

Новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба происходит, вероятно, от “коровьего бешенства”. С 1995 г. подобное заболевание выявлено примерно у 20 пациентов.

А.Е. Любарев

По материалам
SCIENCE, 1996, v. 271, p. 1493–1495

Опубликовано в газете "Биология" (приложение к газете "Первое сентября"), № 4, 1998

Титульный лист | Физико-химическая биология Яндекс.Метрика

Hosted by uCoz